Cum se face o pata Gram

Sterilizați un diapozitiv de sticlă pentru un microscop. Dacă glisorul este murdar, spălați-l cu apă cu săpun pentru a elimina grăsimea și murdăria. Dezinfectați-l cu etanol, detergent de sticlă sau cu metoda recomandată de laboratorul dumneavoastră.

Așezați eșantionul pe diapozitiv. Puteți utiliza metoda de colorare Gram pentru a ajuta la identificarea bacteriilor prezente în probele medicale sau în culturile bacteriene într-un vas Petri. Pentru a folosi colorația Gram, plasați un strat subțire din proba de pe diapozitiv. Se recomandă o probă mai veche de 24 de ore, deoarece bacteriile mai vechi ar putea avea deteriorate pereții celulelor care vor răspunde mai puțin previzibil la pata Gram.

Fixați eșantionul la căldură. Căldura va fixa bacteria în diapozitiv, astfel încât să nu se clătească la fel de ușor în timpul colorării. Glisați rapid glisorul de două sau trei ori prin flacăra unui arzător Bunsen sau încălziți-l pe un dispozitiv electric de încălzire prin glisare. Nu supraîncălziți sau eșantioanele ar putea fi distorsionate. Dacă intenționați să folosiți un arzător Bunsen, flacăra ar trebui să fie un con, albastru, nu înalt, portocaliu.

Poziționați diapozitivul într-o tavă de colorare. O tavă pentru colorare este o tavă mică de metal, sticlă sau plastic, cu o plasă mică sau un suport de sârmă de-a lungul vârfului. Așezați diapozitivul pe acest suport astfel încât lichidele pe care urmează să le utilizați să poată fi drenate pe tavă.

Clătiți ușor paharul violet. Înclinați diapozitivul și utilizați o sticlă de spălare pentru a pulveriza un mic curent de apă distilată sau atingeți vârful diapozitivului. Apa trebuie să picure pe suprafața pensulei, dar să nu fie îndreptată direct spre ea. Nu clătiți excesiv, ceea ce poate elimina colorarea bacterii Gram pozitiv.

Îndepărtați pata cu iod și clătiți-o. Utilizați o pipetă pentru a acoperi pata cu iod. Lăsați-o să stea cel puțin 60 de secunde, apoi clătiți-o cu atenție cu aceeași metodă. Iodul, sub formă de ioni încărcați negativ, interacționează cu ionii CV + pentru a forma compușii cristalini violeți și compușii de iod (compuși CV-I) în straturile interioare și exterioare ale celulei. Aceasta captează culoarea cristalului violet din celulă, în locul în care a fost vopsit.

Adăugați un înălbitor și apoi clătiți rapid. Pentru această etapă critică, se utilizează în mod normal un amestec de acetonă și etanol într-un raport de 1: 1. Finalizarea acestei etape trebuie calculată cu atenție. Țineți diapozitivul într-un unghi, apoi adăugați decolorizatorul până când niciuna dintre culorile violete nu este vizibilă în decolare. Aceasta durează, de obicei, mai puțin de 10 secunde sau chiar mai puțin dacă înălbitorul conține o concentrație mare de acetonă. Opriți-vă imediat sau decolorizatorul va îndepărta colorarea cu cristale violete atât a celulelor Gram pozitive, cât și a celulelor Gram negative, iar colorarea va trebui repetată. Imediat spălați excesul de agent de decolorare folosind tehnica menționată mai sus.

Îndepărtați pata cu o pată secundară și apoi clătiți-o. Un colorant secundar, de obicei safranin sau fucsin, este utilizat pentru a adăuga un contrast suplimentar între bacteriile gram-pozitive și gram-negative, colorând bacteriile decolorate (gram-negative) de roz sau roșu. Lăsați colorantul în probă timp de cel puțin 45 de secunde, apoi clătiți-l.

Uscați diapozitivul. Puteți lăsa diapozitivul să se usuce cu aer sau să îl uscați utilizând hârtie absorbantă care este vândută în acest scop. Pata Gram este terminată.

Identificați bacterii gram pozitive și Gram negative. Examinați diapozitivul sub microscopul luminos. Gram-pozitive bacterii vor arăta violet din cauza cristalului violet prins în pereții lor celule groase. Bacteria gram negativă va arăta roz sau roșu, deoarece violetul a fost clătit prin pereții celulelor subțiri și apoi colorantul secundar roz a fost adăugat la ele.

Căutați imagini de referință. Dacă nu sunteți sigur ce este o bacterie, căutați colecții de imagini de referință clasificate după forma și rezultatul petelor Gram. Puteți găsi baze de date online în Baza de date națională a agenților patogeni microbieni din SUA, Bacterii în fotografii și multe alte site-uri. Pentru a facilita în continuare identificarea, exemple comune sau importante pentru diagnostic sunt clasificate mai jos în funcție de starea și forma Gram.

Identifică bacteriile Gram-pozitive prin forma lor. Bacteriile sunt clasificate ulterior prin forma lor sub microscop, cel mai frecvent ca cocci (sferici) sau tije (cilindrice). Acestea sunt câteva bacterii comune gram pozitive (violet colorat) clasificate după forma:

Identificați bacteriile gram negative Gram-negativ bacterii (colorate roz) sunt adesea clasificate în trei grupe. Coci sunt bacterii sferice, tijele sunt bacterii lungi și subțiri, iar tijele coccoid sunt într-un punct intermediar.

Evaluați rezultatele mixte. Unele bacterii sunt dificil de a vopsi cu precizie din cauza fragilității peretii celulelor lor sau de modul în care sunt ceros. Ele pot avea un amestec de colorare cu violet sau roz pe aceeași celulă sau între celule diferite în aceeași probă. Orice probă de bacterii care are mai mult de 24 de ore poate avea această problemă, dar unele specii sunt dificil de colorant la orice vârstă. Acestea pot necesita teste mai specializate pentru a reduce numărul de posibilități de identificare ca pata Ziehl-Neelsen, observând creșterea culturilor, STI agar-agar sau testarea genetica.